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Linha de Luz Cedro

CeDRO (Circular Dichroism Beamline) é uma linha de luz do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) em fase de montagem no novo acelerador Sirius. Essa linha de luz será dedicada à espectroscopia de dicroísmo circular eletrônico (CD) na região do ultravioleta (UV).  A espectroscopia de CD é baseada na absorção diferencial da luz circularmente polarizada para a esquerda e direita por materiais opticamente ativos. É uma ferramenta valiosa para analisar a estrutura de moléculas quirais, incluindo as biomoléculas como proteínas, ácidos nucléicos e carboidratos. Dentre elas, as proteínas são extensivamente estudadas por CD para quantificar o conteúdo de estrutura secundária em termos de α-hélice, folhas β e estrutura desordenada, além de ser aplicada para investigar a estabilidade e interações com outras moléculas, que se destaca no âmbito de busca de novas drogas.

CONTATO & EQUIPE

E-mail da Instalação: cedro@lnls.br

Coordenação: Juliana S. Yoneda
Tel.: +55 19 3512 1045
E-mail: juliana.yoneda@lnls.br

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LAYOUT & ELEMENTOS ÓTICOS

O espelho M4 será utilizado no futuro para dividir o feixe e gerar uma ramificação para um experimento adicional.

PARÂMETROS

ESTAÇÃO E TÉCNICA EXPERIMENTAL

A linha CEDRO será composta inicialmente por uma estação para a realização de experimentos convencionais de SRCD, utilizando um ambiente para amostras líquidas, com controle de temperatura. O desenvolvimento de um porta amostras com controle de umidade e rotação automática também é previsto para as medidas em fase sólida (filmes desidratados) para experimentos de CD orientado, por exemplo. Além disso, dispositivos de microfluídica serão desenvolvidos para estudos de cinética. Além da estação experimental haverá uma sala de controle, onde os usuários poderão controlar e acompanhar as medições, além de realizar análises prévias enquanto aguardam a execução do experimento. Um laboratório auxiliar também estará disponível para a manipulação de amostras, contendo alguns equipamentos simples de apoio, como banho térmico, agitadores, mini centrífuga, placa de aquecimento, geladeira e freezer.

Visão geral da linha de luz CEDRO: Estação experimental, sala de controle e laboratório de apoio.

DICROÍSMO CIRCULAR COM RADIAÇÃO SÍNCROTRON

A sigla SRCD de Synchrotron Radiation Circular Dichroism é utilizada quando a radiação síncrotron é a fonte de luz para a técnica de CD. Em comparação com as lâmpadas convencionais, utilizadas em equipamentos de bancada, a radiação síncrotron oferece um alto fluxo de fótons, proporcionando maior sensibilidade, além de cobrir uma faixa de comprimentos de onda mais extensa, alcançando a região do ultravioleta de vácuo (UVV- abaixo de 200 nm) com alto fluxo, que tipicamente é inacessível com fontes convencionais [1].

Com a extensão da faixa de comprimento de ondas é possível acessar transições que apresentam sinais de CD na região do UVV, como por exemplo as transições n – σ* dos grupos acetal e hidroxil de sacarídeos, que produzem bandas entre 140 e 180 nm [2]. No caso das proteínas essa extensão tem um impacto significativo na análise quantitativa do conteúdo de estrutura secundária, obtida a partir do espectro de CD. Um espectro pode ser considerado a soma ponderada dos componentes de estruturas secundárias da proteína em questão. A quantidade de informações que podem ser extraídas com precisão depende do número de transições eletrônicas que o espectro apresenta, portanto, quanto maior a faixa de comprimento de onda alcançada mais robusta será a análise. Os espectros que alcançam comprimentos de ondas não inferiores a 200 nm podem ser descritos apenas por dois autovetores permitindo uma estimativa somente de hélices. Esse valor aumenta para três ou quatro quando o espectro é estendido para 190 nm e seis a oito para 170 nm, permitindo a distinção entre um maior número de estruturas secundárias [3]. Portanto, o uso da radiação síncrotron como fonte de luz estende o uso e potencializa a espectroscopia de CD.

[1] BA Wallace. The role of circular dichroism spectroscopy in the era of integrative structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 2019; 58:191–196.
[2] K Gekko. Synchrotron-radiation vacuum-ultraviolet circular dichroism spectroscopy in structural biology: an overview. Biophys Physicobiol. 2019; 16: 41–58.
[3] Lees JG, Miles AJ, Wien F, Wallace BA. A reference database for circular dichroism spectroscopy covering fold and secondary structure space. Bioinformatics. 2006; 22:1955e62.

O feixe proveniente de um dipolo de baixo campo é defletido e focalizado por elementos ópticos antes de chegar ao monocromador (grade dupla subtrativa Hummingbird – OLIS®) (obs. note que o desenho do monocromador é apenas para fins ilustrativos). Uma janela de CaF2 entre a câmara óptica e o monocromador separa a região UHV (ultra alto vácuo) da atmosfera purgada com N2. A luz monocromatizada passa por um polarizador Rochon, que garante a polarização linear do feixe. A luz linearmente polarizada (LLP) é convertida em luz circularmente polarizada (LCP) alternadamente à direita e à esquerda por um modulador fotoelástico (50kHz), que atravessa a amostra antes de chegar ao detector (tubo fotomultiplicador). O sinal de tensão é digitalizado e os espectros do CD são obtidos após o processamento digital.

REQUISITOS DE AMOSTRAS

A preparação da amostra é uma etapa importante do procedimento experimental e a escolha das condições é um fator chave para a obtenção de resultados de qualidade. Como a espectroscopia de CD é baseada na diferença de absorção da luz circularmente polarizada para esquerda e direita por uma amostra quiral, o usuário deve se atentar à absorção geral da amostra. Componentes que absorvem fortemente na região de comprimento de onda de interesse devem ser evitados ou mantidos em concentração baixa para a aquisição de um espectro com um bom nível de sinal-ruído.

Dicas sobre solventes e tampões:

Tampões fosfato, tris e borato são adequados para estudos de CD (260 – 180 nm). Íons cloreto precisam ser evitados, pois absorvem fortemente abaixo de 200 nm. Esteja atento ao usar HCl para ajustar o pH de tampões e também se lembre que Cl está presente na solução salina tamponada com fosfato (PBS). Se a presença de sais for necessária para manter a força iônica, o uso de sulfato ou fluoreto é preferível. HEPES, MOPS, MES, PIPES devem ser usados somente em baixas concentrações. Imidazol, que é usado para eluir proteínas marcadas com His na cromatografia de afinidade imobilizada do íon do metal, deve ser removido por extensa diálise ou permeação em gel, devida a sua alta absorção.

Se os requisitos biológicos dificultam a substituição de certos componentes, o uso de uma célula com caminho óptico menor pode atenuar o problema causado por uma alta absorbância do tampão/solvente. Note que neste caso, a concentração de proteína deverá ser maior, portanto, fique atento se o aumento da concentração de proteína não causará agregação e precipitação.

Um bom conselho é executar alguns testes iniciais para encontrar o melhor caminho óptico da célula de amostras e parâmetros do instrumento.

Recomendamos a leitura de artigos sobre condições experimentais para planejar melhor seus estudos de CD:

  • J. Miles, B.A. Wallace. “Chapter 6 – Circular Dichroism Spectroscopy for Protein Characterization: Biopharmaceutical Applications”. Biophysical Characterization of Proteins in Developing Biopharmaceuticals (2015) 109-137.
  • Kelly, S.M.; Jess, T.J.; Price, N.C. “How to study proteins by circular dichroism”. Biochimica et Biophysica Acta 1751 (2005) 119 – 139.

PORTA AMOSTRAS

 

Solução

Para amostras líquidas, temos duas opções de células. O caminho óptico pode ser escolhido de acordo com a concentração de proteína na amostra. A tabela abaixo pode auxiliar na sua escolha.

Células cilíndricas fechadas com rolhas de Teflon de quartzo Suprasil (Hellma 121.000)

Este tipo de célula é recomendado para estudos com variação de temperatura da amostra (experimentos de estabilidade térmica). Os comprimentos de caminho óptico disponíveis são 0,1, 0,2 e 0,5 mm.

A limpeza pode ser problemática para este tipo de células com caminhos ópticos muito curtos, portanto, é necessária atenção e cuidado neste processo. Por favor, peça ajuda se precisar.

Células circulares desmontáveis de quartzo Suprasil (Hellma 124.000)

Duas placas: uma plana e a outra com borda chanfrada produzindo um poço raso. Os comprimentos de caminho óptico típicos estão entre 0,01 e 0,1 mm.

A limpeza é mais fácil porque as faces podem ser separadas, porém o preenchimento com a amostra pode ser mais trabalhoso. Praticar, por exemplo, com água, antes de carregar a amostra é conveniente para quem ainda não usou este tipo de célula. Atenção deve ser dada para evitar a formação de bolhas. Por favor, peça ajuda se precisar.

Filmes Desidratados

Placa de quartzo Suprasil (Hellma 202)

As placas de quartzo podem ser utilizadas como substratos para a preparação de filmes finos desidratados. A construção de um porta amostras com controle de umidade e estágio de rotação para medições em fase sólida (filmes desidratados) para experimentos de CD orientado é prevista para a utilização na linha CEDRO. Deve-se enfatizar que, ao medir a amostra em filmes, é necessário controlar uma possível interferência de dicroísmo linear devido ao provável alinhamento da amostra durante a secagem. Pode-se realizar a aquisição de espectros em diferentes ângulos de rotação em torno do eixo de propagação do feixe para verificar e minimizar esse efeito.

Cinética

Dispositivos de microfluídica serão desenvolvidos visando estudos de CD resolvidos no tempo.

APLICAÇÕES

DETERMINAÇÃO DA ESTRUTURA SECUNDÁRIA DE PROTEÍNAS

As transições eletrônicas da ligação peptídica nas proteínas ocorrem na região ultravioleta distante (160 a 240 nm). As transições n → π* e π * → π * do cromóforo amida são influenciadas pela geometria das estruturas polipeptídicas; portanto, os espectros de CD são sensíveis às estruturas secundárias das proteínas. Os espectros podem ser deconvoluídos para quantificar as contribuições de diferentes tipos de estrutura secundária no total da estrutura de uma proteína. Diferentes métodos foram desenvolvidos para realizar esta análise. Pode-se usar um conjunto de dados de referência composto por espectros de CD de proteínas com estruturas 3D conhecidas (por exemplo, por cristalografia e difração de raios-X ou RMN) e diferentes algoritmos.

B.A. Wallace. Protein characterisation by synchrotron radiation circular dichroism spectroscopy. (2009) Quarterly Reviews of Biophysics , Volume 42 , Issue 4 , pp. 317 – 370. DOI: 10.1017/S003358351000003X

ESTRUTURA DE PROTEÍNAS EM FILMES DESIDRATADOS

A desidratação de uma solução de proteína formando um filme fino permite as medições de CD abaixo de ~ 168 nm, que normalmente é o comprimento de onda de corte mais baixo para soluções, devido à alta absorção de luz pela água nessa região. A extensão da faixa de energia permite a detecção de transições adicionais, aumentando a quantidade de informações que podem ser extraídas do espectro de CD.

Yoneda JS, Miles AJ, Araujo AP, Wallace BA. (2017) Protein Science, 26(4):718-726. DOI: 10.1002/pro.3118

ESTABILIDADE TÉRMICA

A desnaturação de uma proteína pode ser induzida pelo aumento da temperatura para avaliar a estabilidade térmica da sua estrutura. A temperatura de desnaturação de uma proteína pode ser comparada em diferentes condições do meio/solventes para detectar mudanças em sua estabilidade. Esse tipo de ensaio pode ser útil para detectar a interação de um ligante, pois isso pode causar uma mudança na estabilidade térmica da proteína, sendo uma abordagem importante na busca e desenvolvimento de novas drogas, tendo proteínas como alvo biológico.

Lopes JLS, Yoneda JS, Martins JM, DeMarco R, Jameson DM, Castro AM, et al. (2016) Environmental Factors Modulating the Stability and Enzymatic Activity of the Petrotoga mobilis Esterase (PmEst). PLoS ONE 11(6): e0158146. DOI: 10.1371/journal.pone.0158146

CD ORIENTADO - POR EXEMPLO, ORIENTAÇÃO DE PEPTÍDEOS/PROTEÍNAS EM RELAÇÃO ÀS MEMBRANAS LIPÍDICAS

O dicroísmo circular orientado (OCD) pode ser usado para investigar o alinhamento de peptídeos α-helicoidais em relação à membrana lipídica. A teoria de Moffitt prevê que os momentos de dipolo de transição eletrônica das ligações amida da cadeia de polipeptídeos helicoidais são polarizados paralelos ou perpendiculares ao eixo da hélice. O desdobramento éxciton da transição π – π*, centrada em torno de 200 nm resulta em componentes de vetor paralelos e perpendiculares ao eixo da hélice, dando origem a um pico negativo em 208 nm e um pico positivo em 190 nm. Ao contrário das soluções isotrópicas, onde as proteínas podem assumir todas as orientações relacionadas ao feixe de luz, em uma amostra anisotrópica, o espectro de OCD de um peptídeo α-helicoidal interagindo com a membrana lipídica exibe uma forma de linha no espectro característica e reflete o ângulo entre o eixo da hélice e a normal da bicamada.

*Figura inspirada de Bürck, 2016

Bürck J, Wadhwani P, Fanghänel S, Ulrich AS. Oriented Circular Dichroism: A Method to Characterize Membrane- Active Peptides in Oriented Lipid Bilayers (2016) Acc Chem Res. 49(2):184-92. DOI: 10.1021/acs.accounts.5b00346
A. J. Miles, and B. A. Wallace. Circular dichroism spectroscopy of membrane proteins (2016) Chem. Soc. Rev., 2016,45, 4859-4872. DOI: 10.1039/C5CS00084J